Pembuatan Preparat Irisan Dengan Metode Parafin

Tujuan percobaan ini adalah membuat preparat irisan organ hepar, intestinum, dan ren pada mencit (Mus musculus) melalui penyelubungan dengan media paraffin. Pada dasarnya metode irisan ada 2 macam yaitu metode irisan dengan tangan dan metode irisan dengan mikrotom. Dengan metode mikrotom hasil irisan lebih tipis dan ketebalannya dapat disesuaikan dengan keinginan.

Tahap awal dari percobaan ini adalah narcose (pembiusan), setelah dibius kemudian dilakukan sectio (pembedahan) untuk diambil hepar, intestinum, dan ren-nya.Organ yang sudah diambil kemudian dimasukkan ke dalam garam fisiologis (NaCl 0.9%), tujuannya adalah untuk mempertahankan sel dalam jaringan agar tidak mudah rusak dan membersihkan organ tersebut dari kotoran, darah, maupun rambut-rambut yang masih menempel. Masing organ dipotong dengan ukuran tertentu lalu potongan organ dimasukkan ke dalam larutan fiksatif bouin. Larutan fiksatif ini mengandung asam pikrat jenuh, aquades 75 ml, asam asetat glacial 5 ml, dan formalin 40% 5 ml. Larutan ini dapat melakukan penetrasi dengan cepat sehingga nucleus dan jaringan akan terpulas dengan baik.Tetapi perendaman ini tidak boleh terlalu lama karena akan menyebabkan jaringan menjadi rapuh atau sulit di iris. Fiksasi bertujuan untuk mencegah autolysis dan pembusukan oleh bakteri serta mempertahankan bentuk sel. Asm pikrat dalam dalam larutan bouin berfungsi sebagai zat warna yang akan menberikan warna kuning dalam jaringan. Langkah selanjutnya adalah washing dengan alcohol 70% yang berfungsi untuk menghilangkan warna kuning pada organ setelah fiksasi.

Langkah selanjutnya adalah dehidrasi yang bertujuan untuk menghilangkan molekul air dan menggantinya dengan molekul alcohol. Molekul air harus ditarik keluar karena paraffin dan air tidak dapat bercampur. Dehidrasi delakukan dengan alcohol bertingkat. Tujuannnya adalah agar tidak ada perubahan secara tiba-tiba terhadap sel yang dapat menyebabkan kerusakan struktur sel. Proses ini dilakukan + 30 menit setiap kali perendaman. Jika dilakukan terlalu lama dapat menyebabkan pengerasan pada jaringan.

Langkah selanjutnya adalah clearing, bertujuan untuk menjernihkan potongan jaringan. Dalm proses ini menggunakan toluol. Toluol dapat bercampur dengan paraffin maupun dehidran (alcohol). Kelebihan dari penggunaan toluol adalah perosesnya cepat dan hasilnya bagus (jernih), namun jikaterlalu lama dapat mengeraskan jaringan. Clearing disebut juga dealkoholisasi jika dehidrannya alcohol.

Proses selanjutnya adalah infiltrasi yaitu penyisipan cairan paraffin ke dalam jaringan.Tujuan dari proses ini adalah untuk mengadaptasikan dengan media paraffin. Caranya adalah masukkan organ ke dalam larutan xylol:paraffin (1:1) selama 1 jam di dalam oven dengan suhu 55°-60°C. Jika infiltrasi dilakukan di bawah suhu 55°C maka paraffin cair akan cepat membeku dan jika dilakukan pada suhu di atas 60°C maka organ dapat matang. Setelah itu, organ dimasukkan ke dalam larutan paraffin I, paraffin II, dan paraffin III masing-masing selama 30 menit. Pemindahan harus dilakukan secara cepat agar paraffin tidak membeku.

Proses selanjutnya adalah embedding (penanaman jaringan ke dalam blok paraffin), saat penanaman perlu diperhatikan posisi dari organ, apakah tujuannnya ingin mendapatkan penampang melintangnya atau penampang bujurnya. Pada organ intestinum di tanam dalam posisi berdiri karena akan dibuat penampang melintangnya, sedangkan untuk hepar dan ren dalam diletakkan sembarang karena struktur selnya sama di semua sisi. Pada cetakan dituang sedikit paraffin setelah itu diletakkan organnya kemudian dituang parafinnya dan diletakkan kaset parafinnya. Setelah itu di diamkan dan di masukkan ke dalam freezer agar paraffin cepat mengeras. Setelah itu blok paraffin di lepas dari cetakannya.

Langkah selanjutnya yaitu sectioning dengan mikrotom. Dilakukan dengan cara menempatkan kaset paraffin pada holder mikrotom kemudian ketebalan ditentukan pada ukuran 6µm, setelah siap baru dilakukan mikrotoming hingga semua potongab organ pada paraffin teriris. Hasil dari proses mirotoming di tamping dengan kertas dan irisan-irisan ini disebut coupes. Hasil mikrotoming terkadang terlihat menggulung dan pecah, hal ini kemungkinan disebabkan kerena proses infiltrasi kurang sempurna atau karena proses embedding kurang tepat.

Proses selanjutnya adalah affixing yaitu penempelan coupes pada gelas benda. Sebelum dilakukan affixing gelas benda dibersihkan terlebih dahulu kemudian diolesi dengan albumin meyer. Komposisi albumin meyer adalah albumin telur 50 ml, gliserin 50 ml, dan natrium salisilat 1 gr. Albumin meyer berfungsi untuk merekatkan coupea dengan gelas benda. Jika coupes terlihat mengkerut, maka sebelum diletakkan di atas gelas benda coupes-coupes ini diletakkan terlebih dahulu di atas air hangat untuk menghilangkan kerutan. Kemudian setelah coupes lurus baru diambil dengan gelas benda secara langsung, dimana gelas benda terlebih dahulu di olesi dengan albumin meyer. Diusahakan coupes berada tepat di tengah-tengah gelas benda agar nantinya mudah diamati.

Proses selanjutnya adalah deparafinasi yang bertujuan untuk menghilangkan paraffin yang masih menempel. Untuk menghilangkannya di gunakan xylol karena xylol dapat melarutkan paraffin. Deparafinasi dilakukan melalui 2 tahap yaitu merendam preparat dalam larutan xylol I selama 15 menit dan larutan Xylol II selama 5 menit. Hal ini bertujuan agar paraffin benar-benar hilang.

Tahap selanjutnya adalah Staining (pewarnaan), pewarna yang di gunakan yaitu HE (Hematoxylin Eosin). Hematoxilin akan mewarnai inti sel menjadi ungu atau merah sedagkan Eosin akan mewarnai sitoplasma sitoplasma menjadi merah muda. Hematoxylin merupakan pewarna suksedan yaitu  zat warna yang diberikan secara bergantian (terpisah). HE merupakan pewarna yang bersifat asam sehingga dapat terjadi pewarnaaan regresif. Oleh karena itu, sebaiknya digunakan deferensiator basa yaitu bahan yang bersifat alkali, dalam hal ini digunakan Hematoxylin Ehrlich yang mempunyai komposisi Hematoxylin (0,67 gr), alcohol absolute (33 ml), akuades (33 ml), gliserol (33 ml), dan asam asetat glacial (3,3 ml). Hematoxylin yang paling baik digunakan adalah pada saat warnanya ungu karena pada saat itu hematoxylin baru teroksidasi sebagian. Hematin pada Hematoxylin mempunyai afinitas kecil terhadap jaringan Gliserin yang terkandung dalam Hematoxylin Ehrlish yang berguna untuk mencegah overstain dan memperlambat proses pewarnaan. Sedangkan asam asetat glacial berfungsi untuk menaikkan intensitas zat warna serta mencegah pewarnaan komponen sitoplasma. Alkohol absolute serta akuades membantu proses ripening dari hematoxylin.

Eosin adalah zat warna golongan xantine yang mempunyai molekul yang terdiri dari molekul guinonoid yang dihubungkan oleh cincin nonquinonoid oleh atom C dan O. Eosin digunakan sebagai background stain atau counter stain yaitu zat warna yang berfungsi untuk memberikan warna kontras dengan zat warna yang diberikan lebih dahulu. Jika eosin diberikan dalam konsentrasi yang tinggi akan menghilangkan warna dari zat warna basa.

Tahapan pewarnaan yaitu mula-mula jaringan dibawa ke alcohol bertingkat dari tinggi ke rendah, yakni alcohol 96%, 90%, 70%, 60%, masing-masing cukup 1 celupan. Kemudian dimasukkan ke dalam akuades. Tahap ini bertujuan untuk pengadaptasikan jaringan ke kondisi basa karena sifat hematoxylin adalah basa. Setelah dimasukkan ke aquades langkah selanjutnya adalah dimasukkan ke dalam larutan Hematoxylin selama + 5 detik, jika terlalu lama warna akan sangat pekat dan menyebabkan sulit dibersihkan, selain itu dapat menyebabkan jaringan menjadi keras akibat oksidasi hematin. Kemudian dibersihkan dengan air yang mengalir selama 10 menit. Langkah selanjutnya yaitu pewarnaan dengan Eosin, mula-mula dimasukkan ke dalam aquades lalu dimasukkan ke alcohol bertingkat dari rendah ke tinggi,yaitu 60%, 70%, hal ini bebagai bentuk pengadaptasian ke kondisi eosin 2 % dalam alcohol 70 % lalu dimasukkan ke dalam pewarna eosin selama 3 menit. Tahap selanjutnya dimasukkan ke dalam alcohol 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing 1 celupan. Kemudian di rendam ke dalam xylol selama 15 menit untuk proses penjernihan (clearing).

Langkah selanjutnya adalah mounting dengan menggunakan enthelan. Enthelan bersifat non aquosa dan larut dalam xylol. Enthelan dipilih sebagai mounting agen karena dapat merekatkan jaringan ke gelas benda dan penutup, mempunyai indeks refraksi  yang cukup tinggi, tidak berwarna, dan bersifat netral serta non aquosa sehingga tidak merusak jaringan.

Tahap terakhir adalah labeling yaitu memberikan keterangan preparat, dengan cara di tempel pada salah satu sisi gelas benda. Ditulis jenis penampangnya, nama organ, nama spesies, dan pewarnaan dan perbesarannya berapa.