Jumat, 29 November 2013

Pembuatan Preparat Wholemount Fetus Tikus Putih (Rattus sp.)



Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui susunan tulang rawan dan tulang keras fetus tikus putih (Rattus sp.) berdasarkan perbedaan penyerapan terhadap zat warna. Preparat whoulemount digunakan untuk melihat preparat secara keseluruhan tanpa pengirisan. Metode ini biasa di gunakan untuk specimen yang masih dalam tahap perkembangan (pada embrio/fetus yeng berukuran kecil).
Tahap pertama adalah pembedahan, abdomen dibedah lalu fetusnya di keluarkan. Fetus ini kemudian di fiksasi dengan alcohol 95% hingga fetus melunak. Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan struktur fetus, menghindari pembusukan oleh bakteri dan menudahkan pengabsorbsian zat warna. Fiksasi dilakukan selama 1-4 hari.
Tahap selanjutnya adalah viscerasi yaitu pembuangan organ dalam , kulit, dan jaringan lemak dengan pinset. Tujuan dari viscerasi adalah untuk mempermudah penyerapanzat warna ke dalam tulang. Setelah di viscerasi fetus dimasukkan ke dalam aseton selama + 24 jam untuk melarutkan lemak yang masih menempel pada tulang.
Setelah itu, tahap selanjutnya adalah staining (pewarnaan). Pewarna yang digunakan adalah pewarna ganda yaitu alcian blue dan alizarin red S. Komposisi pewarna ini adalah alcian blue 0,3% dalam etanol 70% (1 bagian), Alizarin red S 0,1 % dalam etanol 95% (1 bagian), asam asetat glacial (1 bagian), dan etanol 70% (1 bagian). Penggunaan pewarna ganda ini karena tulang fetus tersusun dari beberapa jenis tulang (tulang rawan dan tulang keras), masing-masing akan memiliki afinitas yang berbeda dalam penyerapan zat warna sehingga akan terlihat perbedaan jenis tulang tersebut. Kartilago (tulang rawan) akan terwarnai oleh alcian blue yang merupakan zat warna basa yang akan memberikan warna biru pada tulang, sedangkan alizarin red S bersifat asam yang akan memberikan warna merah pada osteum (tulang kera). Mekanisme pewarnaan ini terjadi karena muatan saling berikatan. Pada alizarin red S yang bersifat asam akan melepaskan muatan positif, sedangkan ostium yang bersifat basa akan melepaskan muatan negative sehingga osteum dapat mengikat zat warna dari alizarin red S tersebut. Begitu juga pada pewarna alcian blue dengan kartilago. Kartilago yang bersifat asam akan mengikat zat warna alcian blue yang bersifan basa. Asam asetat glacial dalam pewarnaan ini berfungsi untuk mencegah pengerasan pada jaringan dan membentu mempercepat penetrasi zat warna. Staining dilakukan selama + 24 jam.
Tahap selanjutnya adalah washing (pencucian), dilakukan dengan air yang mengalir beberapa kali hingga bersih. Air merupakan senyawa polar sehingga akan menarik cairan yang terserap fetus serta akan mengembalikan keadaan jaringan ke kondisi semula. Fungsi dari proses washing adalah untuk membersihkan sisa-sisa zat warna.
Setelah selesai, tahap selanjutnya adalah clearing (penjernihan) dengan KOH 1 % selama 1 hari hingga jaringan yang membungkus tulang rangka (skeleton) menjadi transparan. Clearing yang dilakukan terlalu lama dapat menyebabkan tulang hancur. Fetus selanjutnya disimpan dalam larutan gliserin supaya lebih awet, sehingga fetus diadaptasikan secara berturut-turut dalam larutan KOH 1 % : gliserin (3:1), kemudian larutan KOH 1% : gliserin (1:1), kemudian larutan KOH 1% : gliserin (1:3). Masing-msing selama 1 jam. Terakhir disimpan dalam gliserin 100%, lalu di amati perbedaan penyerapan warnanya.
Pada preparat tulang keras berwarna merah, sedangkan tulang rawan berwarna biru kehijauan. Tulang rawan terletak pada persambungan antara tulang-tulang pendek ekstemitas ekor dan persendian.

Tidak ada komentar:

Posting Komentar